Analysis on drug-resistance and genome characteristics of clinical isolates of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa from sentinel hospitals of Jiangsu, 2016−2023
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摘要:目的
了解江苏省临床分离的耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的耐药、血清型及基因特征。
方法收集2016—2023年江苏省各哨点医院临床分离的耐碳青霉烯铜绿假单胞菌，采用肉汤稀释法对分离株进行10类19种抗生素的敏感性测定，将分离株全基因组测序并多位点序列分型，血清型预测，对耐药基因、转座子及可移动元件进行分析。
结果本研究收集患者分离耐碳青霉烯铜绿假单胞菌菌株68株。 药敏实验结果显示，全部菌株对氯霉素、复方新诺明、头孢噻肟和头孢唑啉、四环素、氨苄西林和氨苄西林–舒巴坦以及阿莫西林–克拉维酸共计7类9种抗生素全部耐药，检出33种耐药表型，其中2株菌是对所有19种抗生素耐药的泛耐药菌株。 所有分离株鉴定出43个序列型（ST），ST235数量最多，聚类图显示，以ST241中心点向两个主要方向发散。 共检出8个血清型，以O6、O11和O3血清型为主，占全部菌株的67.65%。 共检出8类23种抗生素耐药基因，54.41%（37/68）的菌株存在整合和共轭元件，39.71%（27/68）的菌株存在整合和移动元件，未发现有菌株携带质粒。
结论本研究从基因组水平阐述了江苏省耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药性、高风险ST型和高耐药性/血清型的特征情况，为有效治疗及防控该菌引起的感染提供了科学依据。
Abstract:ObjectiveTo understand the drug resistance and genome characteristics of clinical isolates of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa (CRPA) in Jiangsu province.
MethodsClinical CRPA isolates from sentinel hospitals in Jiangsu from 2016 to 2023 were collected. The susceptibility test to 19 antibiotics in 10 classes was conducted by broth dilution method. Whole genome sequencing, multi-site sequence typing and serotype prediction were conducted for the isolates, and their drug resistance genes, transposons and mobile elements were analyzed.
ResultsA total of 68 strains of CRPA isolated from patients were collected. The results of drug susceptibility test showed that all the strains were resistant to 9 antibiotics in 7 classes, i.e. chloramphenicol, cotrimoxazole, cefotaxime, cefazolin, tetracycline, ampicillin, ampicillin/sulbactam and amoxicillin-clavulanate, and 33 drug-resistance phenotypes were found. Two of the strains were pan-drug-resistant to all 19 antibiotics tested. Forty-three sequence types (STs) were identified in all the isolates, ST235 was predominant. The clustering diagram showed that ST241 was in the central of all STs. A total of 8 serotypes were identified, mainly O6, O11 and O3 in 67.65% of all the strains. A total of 23 antibiotic resistance genes to 8 classes of antibiotics were found. In the 68 strains, 54.41% had integrated and conjugate elements, 39.71% had integrated and mobile elements, and no strains were found to carry plasmid.
ConclusionIn this study, the characteristics of the drug resistance, high risk ST and high resistance/serotype of carbapenem-resistant P. aeruginosa in Jiangsu were described at genome level, providing scientific evidence for effective treatment and prevention of infection caused by P. aeruginosa.
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铜绿假单胞菌为革兰阴性条件致病菌，可定植在人类的皮肤表面、消化道和呼吸道等部位，还是医院获得性感染的主要病原体之一，可引起多种感染［1］。铜绿假单胞菌复杂的基因组也赋予其抗生素耐药性，通常对β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素表现出高度的耐药性［2］。近几年，因多重耐药（multidrug-resistant，MDR）和广泛耐药（extensively-drug resistant，XDR）铜绿假单胞菌导致的院内感染的显著增多而引起人们的广泛关注。碳青霉烯类抗生素作为广谱类抗生素常用于治疗包括假单胞菌在内的革兰阴性多重耐药菌引起的感染，但由于抗生素的不合理滥用，以及碳青霉烯类抗生素广泛用于控制铜绿假单胞菌的严重感染，以及复杂的耐药机制，耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA）开始大规模出现，给医院内感染治疗带来了巨大的负担和挑战［3］。2017年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将CRPA列为“极为关注”的“重点耐药病原体”［4］。
铜绿假单胞菌的基因组大小通常在5.5 Mb～7 Mb，其庞大的基因组也赋予了其在广泛环境中生存的能力［5］。铜绿假单胞菌的核心基因组中包含生存所需的必要基因，非必需基因组通常由水平可转移元件组成，包括整合子、基因组岛、前噬菌体基因等［5］。多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是当前最常用的分子分型工具之一［6］，因其操作简单、重复性好、数据便于共享，广泛应用于细菌分子流行病学、遗传进化及溯源调查。有研究表明，铜绿假单胞菌的血清型与一些全球传播的高风险MLST克隆簇相关，多为MDR/XDR菌株，可引起严重感染［7］。基因组学分析铜绿假单胞菌的序列型（sequence type，ST）、血清型、耐药基因和毒力基因是当研究铜绿假单胞菌流行的一种非常有效的方法。
本研究对2016－2023年江苏省哨点医院分离的68株CRPA进行了耐药表型、耐药基因、ST型、血清型分析，探讨了碳青霉烯类抗生素耐药性与血清型、ST型的关系，以补充本地区CRPA的感染和流行情况和多种抗生的耐药数据及基因特征，这将有助于提升铜绿假单胞菌耐药性传播的认识，为本地区CRPA在医院内感染的诊断治疗及预防控制提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 菌株来源
依托国家致病菌识别网，在江苏省13个设区市设立的哨点医院，收集2016－2023年临床分离自患者的铜绿假单胞菌株。本研究中药物敏感实验的质控菌株来源于中国食品药品检定研究院，铜绿假单胞菌标准菌株（ATCC27853）。
1.2 试剂与仪器
含5%脱纤维羊血琼脂平板购自苏州启新公司，细菌核酸提取试剂（FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，德国布鲁克公司生产的全自动细菌鉴定质谱仪（Microflex LT/SH smart MALDI TOF MS System），致病菌识别网定制的铜绿假单胞菌药敏板（NMIC/ID-4）和全自动微生物鉴定药敏分析系统（Phoenix M50）为美国BD公司生产，生物安全柜和−80 ℃冰箱为美国Thermo公司生产。
1.3 药敏试验
采用微量肉汤稀释法对进行抗生素最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）分析，10类19种抗生素包括阿米卡星（amikacin，AN）、阿莫西林–克拉维酸（amoxicillin-clavulanate，AMC）、氨苄西林（ampicillin，AM）、氨苄西林–舒巴坦（ampicillin-sulbactam，SAM）、氨曲南（aztreonam，ATM）、头孢唑啉（cefazolin，CZ）、头孢吡肟（cefepime，FEP）、头孢噻肟（cefotaxime，CTX）、头孢他啶（ceftazidime，CAZ）、氯霉素（chloramphenicol，C）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、庆大霉素（gentamicin，GM）、亚胺培南（imipenem，IPM）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）、美罗培南（meropenem，MEM）、哌拉西林（piperacillin，PIP）、哌拉西林–他唑巴坦（piperacillin-tazobactam，TZP）、四环素（tetracycline，TE）、复方新诺明（trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT）。根据美国临床实验室标准协会M100-S31文件标准和中国疾病预防控制中心传染病预防控制所的《疾控系统药敏判读标准》判读结果，抗生素敏感性结果分为耐药、中介和敏感3种。至少对IPM和MEM中的1种抗生素耐药的菌株判定为CRPA。
1.4 全基因组测序分析
刮取新鲜培养的菌落加入含200 μL无菌水的离心管中，按试剂盒说明书操作步骤提取细菌全基因组DNA，质控合格后送华大基因建库（≤800 bp常规文库），全基因组重测序平台为BGISEQ-2000。利用CLC genomics workbench软件（Qiagen）对测序数据进行质控和组装拼接，提取为fasta文件，并进行平均核苷酸一致性鉴定（average nucleotide identity，ANI）。PAst在线数据库预测血清型(https://cge.food.dtu.dk/services/PAst/)。Microbial Genomics Module模块在ResFinder和综合抗生素耐药性数据库扫描比对耐药基因。Rast在线数据库注释分析耐药基因和转座子，PlasmidFinder鉴定可能的质粒基因，PAst 1.0预测血清型，ICEfinder鉴定整合和共轭元件。
1.5 MLST分析
美国国立生物技术信息中心（NCBI）在线数据库（https://pubmlst.org/organisms/pseudomonas-aeruginosa）进行MLST比对，确定每株菌的ST型，并将7个基因数字作为字符型数据，运用BioNumerics 8.0（Applied Maths， Belgium）软件，非加权配伍组平均法进行聚类分析。
2. 结果
2.1 菌株情况
本实验室通过致病菌识别网2016－2023年从哨点医院收集院感患者标本分离的铜绿假单胞菌165株，质谱和综合生化进行鉴定，通过药敏实验检出68株CRPA，主要分离自患者的痰液标本（86.76%，59/68），其他标本较少（表1）。
表 1 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌样本来源Table 1. Source of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa from Jiangsu province, 2016−2023耐药类型 标本来源（份） 痰液 脓液或伤口分泌物 中段尿 全血 肺泡灌洗液 R＋S 2 1 0 0 0 R＋I 7 1 0 0 0 R＋R 50 2 2 2 1 注：R＋S. 亚胺培南耐药、美罗培南敏感；R＋I. 亚胺培南耐药、美罗培南中介；R＋R. 亚胺培南、美罗培南双耐药。 2.2 耐药性分析
本研究中68株菌对10类共计19种抗生素的耐药结果（表2）。对IPM、MEM双耐药的菌株为83.82%（57/68），IPM耐药、MEM中介的为11.76%（8/68），IPM耐药、MEM敏感的为4.41%（3/68）。全部菌株对C、SXT、CTX和CZ、TE、AM、SAM及AMC共计6类8种抗生素全部耐药。对另外10种抗生素均有不同的程度的耐药性。针对铜绿假单胞菌最敏感的3种抗生素分别为AN（64/68，94.12%）和GM（53/68，77.94%），以及的PIP（36/68，52.95%）。
表 2 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌对19种抗生素敏感性Table 2. Sensitivity of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomnas aeruginosa to 19 kinds of antibiotics in Jiangsu province, 2016−2023抗生素种类 抗生素名称 耐药 中介 敏感 菌株数 构成比（%） 菌株数 构成比（%） 菌株数 构成比（%） 酰胺醇类 氯霉素 68 100.00 0 0.00 0 0.00 磺胺类 复方新诺明 68 100.00 0 0.00 0 0.00 碳青霉烯类 亚胺培南 68 100.00 0 0.00 0 0.00 美罗培南 57 83.82 8 11.76 3 4.42 头孢菌素类 头孢噻肟 68 100.00 0 0.00 0 0.00 头孢他啶 33 48.53 8 11.76 27 39.71 头孢唑啉 68 100.00 0 0.00 0 0.00 头孢吡肟 35 51.47 13 19.12 20 29.41 四环素类 四环素 68 100.00 0 0.00 0 0.00 喹诺酮类 环丙沙星 34 50.00 8 11.76 26 38.24 左氧氟沙星 43 68.24 4 5.88 21 30.88 氨基糖苷类 阿米卡星 4 5.88 0 0.00 64 94.12 庆大霉素 11 16.18 4 5.88 53 77.94 青霉素类 氨苄西林 68 100.00 0 0.00 0 0.00 氨苄西林–舒巴坦 68 100.00 0 0.00 0 0.00 哌拉西林 25 36.76 7 10.29 36 52.95 单环内酰胺类 氨曲南 35 51.47 11 16.18 22 32.35 β-内酰胺类 哌拉西林–他唑巴坦 23 33.82 12 17.65 33 48.53 阿莫西林–克拉维酸 68 100.00 0 0.00 0 0.00 2.3 耐药谱分析
江苏省内68株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药模式多样（表3），共有33种耐药表型，耐药谱为AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-IPM-TE-SXT的菌株最多，占11.76%（8/68）。耐药情况最严重的耐药物谱分别为19种抗生素的AN-AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT、耐18种抗生素的AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 2株及AN-AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT为1株。
表 3 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药谱Table 3. Drug resistance pattern of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomnas aeruginosa in Jiangsu province, 2016−2023非敏感药物数（种） 非敏感药物谱 菌株数(株) 构成比(%) 19 AN-AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 2 2.94 18 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 2 2.94 AN-AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 17 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 6 8.82 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TE-SXT 1 1.47 16 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 3 4.41 AN-AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 15 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-IPM-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 4 5.88 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 14 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-GM-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 13 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-CAZ-C-IPM-MEM-TZP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-C-CPI-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 12 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 4 5.88 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 4 5.88 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-C-CIP-IPM-LVX-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-PIP-TE-SXT 1 1.47 11 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-CIP-IPM-LVX-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-GM-IPM-MEM-TE-SXT 1 1.47 10 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 6 8.82 9 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-IPM-TE-SXT 8 11.76 注：C. 氯霉素；SXT. 复方新诺明；IPM. 亚胺培南；MEM. 美罗培南；CTX. 头孢噻肟；CAZ. 头孢他啶；CZ. 头孢唑啉；FEP. 头孢吡肟；TE. 四环素；CIP. 环丙沙星；LVX. 左氧氟沙星；AN. 阿米卡星；GM. 庆大霉素；AM. 氨苄西林；SAM. 氨苄西林–舒巴坦；PIP. 哌拉西林；ATM. 氨曲南；TZP. 哌拉西林–他唑巴坦；AMC. 阿莫西林–克拉维酸。 2.4 测序与组装
本研究中收集到的分离株测序数据组装后由31～99个contig片段组成，菌株基因组平均大小为6 513 572 bp（最小6 156 388 bp，最大7 279 290 bp），GC含量均范围为65.53%～66.65%，基于全基因组ANI＞98.86%，按ANI＞95.00%作为同一菌种的判定依据，均属于同一种菌。
2.5 血清型与MLST分析
在线平台pub-MLST数据库中鉴定每株菌的7个等位基因号以及ST型。结果显示68株铜绿假单胞菌存在43个ST型，ST235（7株）、ST902（4株）、ST508（3株）、ST1076（3株）和ST1971（3株）共5个ST型的菌株较多。68株菌被鉴定出8个血清型，其中出现最多的为血清型O6（18/68，26.47%），O11（17/68，25.00%）和O3（11/68，26.18%）。聚类图显示所有的ST型，以ST241中心点向两个主要方向发散，并且聚类图显示各血清型菌株与ST型相对固定（图1）。
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图 1 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞临床分离株多位点序列分析聚类树图注：ST. 序列型。Figure 1. The multilocus sequence typing phylogenetic tree of 68 carbapenem-resistant of Pseudomnas aeruginosa clinical isolates from Jiangsu province, 2016−2023本研究将IPM、MEM双耐药，IPM耐药、MEM中介及IPM耐药、MEM敏感的菌株分为3个集合，与血清型和ST型结果进行比较（图2）。MLST结果显示3种集合均有独占的ST型，但无共享ST型。而血清型结果显示，仅IPM、MEM双耐药合集有3个独占血清型（O4、O9、O11），同时3个集合存在一个共享血清型（O5）。
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图 2 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌与血清型（A）及与序列型（B）关系图注：R＋R. 亚胺培南、美罗培南双耐药；R＋I. 亚胺培南耐药、美罗培南中介；R＋S. 亚胺培南耐药、美罗培南敏感；纵坐标表示血清型和序列型个数。Figure 2. Relationship between serotype (A) and sequence type(B) of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in Jiangsu province, 2016−20232.6 耐药基因携带情况
本研究中68株CRPA介导对β-内酰胺类、酰胺醇类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、利福霉素类和链阳菌素类一共存在8类23种抗生素耐药基因（图3），分别是β-内酰胺酶基因的blaPAO、blaOXA-488、blaVIM-2、blaTEM-1B、blaPER-1、blaGES-1；氨基糖苷类相关耐药基因aac(3)/aac(6')、aadA6/A13和aph(3')-IIb、aph(3')-XV、aph(4)-Ia、aph(6)-Id、ant(2'')-Ia、rmtB；喹诺酮类耐药相关的环丙沙星磷酸转移酶基因crpP；四环素类耐药基因如tet(G)、tet(J)及比较少见的TOprJ3；酰胺醇类的相关耐药基因如cmlA1和catB7；介导磺胺类的耐药基因sul、针对合成类广谱抗生素甲氧苄啶的耐药基因dfrA1和dfrB1、抗生素灭活基因fosA。结果显示所有菌株携带aph(3')-IIb、blaPAO、blaOXA-488及catB7，除一株菌（PA-2023-25）外其他全部携带耐药基因fosA，33.82%（23/68）的菌株携带喹诺酮类抗生素耐药相关的关键基因crpP。同时未发现有菌株携带质粒结构，但54.41%（37/68）的菌株存在整合和共轭元件，39.71%（27/68）的菌株存在整合和移动元件，并且大部分的严重耐药菌（耐药株数≥16）和全耐药菌都携带转座子。
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图 3 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯类铜绿假单胞临床分离株耐药基因聚类热图注：ICE. 整合和共轭元件；IME. 整合和移动元件；红色表示携带该基因，蓝绿色表示不携带该基因。Figure 3. Clustering heat map of drug resistance genes include 68 carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates in Jiangsu province, 2016−20233. 讨论
铜绿假单胞菌对营养要求不高，在环境中具有极强的适应性和耐受能力，因此在自然界广泛存在［5］。同时因其又具备产毒性和侵入性，易引起免疫功能低下或受损患者等特殊人群多部位的反复感染，如呼吸道、肺部、尿路感染、烧伤、免疫受损、心脏瓣膜及手术等部位的感染，甚至会通过血液引起全身感染，是导致院内感染的最重要条件致病菌之一［8］。本次调查收集的菌株来源江苏省致病菌识别网致病菌哨点医院的微生物实验室，具有一定的代表性，2016－2023年共收集到分离自患者的68株CRPA分离株，大部分标本来自呼吸道标本（痰液或肺泡灌洗液），其他种类标本较少，可能和近几年医院对呼吸道症状的患者较重视有关。
铜绿假单胞菌存在固有耐药性，本研究结果显示江苏省CRPA耐药性严重，所有分离株对C、SXT、CTX和CZ、TE、AM、SAM及AMC共计7类9种抗生素全部耐药。同时对其他抗生素的耐药性也在33.76%～83.82%，临床上也常用喹诺酮类抗生素治疗铜绿假单胞菌的感染，但本研究结果显示铜绿假单胞菌对CIP（50.00%）和LVX（68.24%）也存在较高的耐药性，高于此前云南和浙江省的报道［3，9–10］，仅AN（5.88%）及GM（16.18%）的耐药性维持较低的水平。国际上对细菌耐药的中介率较关注，这是细菌耐药趋势的一个重要指标，本研究发现有11.76%～19.12%的分离株对头孢菌素类和β-内酰胺类抗生素的结果为中介，应引起高度关注。本研究中收集的CRPA全部为多重耐药菌，耐药种类在AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-TE-SXT的基础上递增，甚至出现2株对所有抗生素耐药的超级耐药菌株出现，耐10种抗生素的菌株达到88.24%，耐15种抗生素的菌株达到38.24%，需高度关注铜绿假单胞菌多重耐药性的趋势。
目前，许多具有全球传播性的高风险克隆菌株（如ST111、ST175、ST235和ST663）［11］，通常是MDR/XDR菌株，具有明确的传播能力和引起严重感染的能力。本研究发现省内CRPA的ST型较分散，鉴定出43个ST型，其中高风险的ST235最多（n=7），说明江苏省ST型更分散及多样化。本研究中发现的两株全耐药菌分别为ST277和ST675，该菌株在临床治疗上无药可用，一旦引起感染极度凶险，因此需建立针对CRPA的监测，防止扩散。
有研究表明，血清型O1、O6、O11和O12的分离株占铜绿假单胞菌感染的65%以上［12］，血清型O4和O12分离株通常与对各种抗生素的耐药性有关［13］。本研究通过在线网站预测，共发现8个血清型，其中出现最多的为血清型O6，O11和O3，占全部菌株的67.65%（46/68），未发现O12菌株。此前有报道血清型O4，O12与铜绿假单胞菌的多种耐药相关，本研究中两株全耐药菌株分别为O2和O6，3株耐18种抗生素血清型为O11，该结果与以往研究略有不同，可能和地域差异或近3年由于疫情的影响导致细菌所处的环境发生改变有关。同时研究发现ST型与血清型高度一致，相同ST型菌株均为同一种血清型。
铜绿假单胞菌能通过水平基因转移获得耐药基因从而产生耐药性并形成超级耐药细菌。本研究运用二代测序技术获得细菌的基因组信息，再运用生物信息学手段进行全面扫描分析。通过ResFinder数据库比对，共检出8类23种获得性耐药基因，对碳青霉烯类药物的耐药机制主要依靠改变外膜通透性、外排泵过表达、抗生素灭活酶或生物膜等，CRPA主要依靠β-内酰胺酶，因此本研究中的菌株均携带两种及以上的bla类耐药基因。值得注意的是喹诺酮类抗生素耐药基因crpP的携带率低于耐药表型，可能是其他如外排泵或菌膜等机制参与了细菌对该抗生素的抵抗，该现象值得进一步的研究。同时各分离株的基因组大小存在差异，耐药严重菌株基因组大于平均值，并携带多种耐药基因（如tet、aad、cml、drf等）、多种ICEs（T4SS或携带耐药基因），大多数获得性碳青霉烯酶基因存在于Tn402类转座子的I类整合子上，且该整合子都含有介导对其他抗生素耐药的基因盒，导致严重耐药菌甚至泛耐药菌/全耐药菌的产生。本研究收集的CRPA菌株内均未发现质粒结构。
细菌耐药性日益严重的大背景下，铜绿假单胞菌针对碳青霉烯类抗生素的耐药问题也越发突出。治疗CRPA感染的药物选择较为有限，一般推荐使用新型β-内酰胺类抗生素或联合用药。本研究基于国家致病菌识别网监测收集哨点医院上送的部分铜绿假单胞菌，通过对耐药性、流行血清型、ST型及耐药基因和可移动元件的研究，并从基因组水平提升了江苏省强耐药性、高风险ST型和高耐药性/血清型CRPA的认识，虽然本研究中菌株数量较少，但有一定的代表性，丰富了江苏省临床铜绿假单胞菌的数据，为有效治疗及防控提供了强有力的支撑。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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图 1 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞临床分离株多位点序列分析聚类树图
注：ST. 序列型。
Figure 1. The multilocus sequence typing phylogenetic tree of 68 carbapenem-resistant of Pseudomnas aeruginosa clinical isolates from Jiangsu province, 2016−2023
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图 2 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌与血清型（A）及与序列型（B）关系图
注：R＋R. 亚胺培南、美罗培南双耐药；R＋I. 亚胺培南耐药、美罗培南中介；R＋S. 亚胺培南耐药、美罗培南敏感；纵坐标表示血清型和序列型个数。
Figure 2. Relationship between serotype (A) and sequence type(B) of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in Jiangsu province, 2016−2023
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图 3 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯类铜绿假单胞临床分离株耐药基因聚类热图
注：ICE. 整合和共轭元件；IME. 整合和移动元件；红色表示携带该基因，蓝绿色表示不携带该基因。
Figure 3. Clustering heat map of drug resistance genes include 68 carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates in Jiangsu province, 2016−2023
表 1 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌样本来源
Table 1 Source of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa from Jiangsu province, 2016−2023
耐药类型 标本来源（份） 痰液 脓液或伤口分泌物 中段尿 全血 肺泡灌洗液 R＋S 2 1 0 0 0 R＋I 7 1 0 0 0 R＋R 50 2 2 2 1 注：R＋S. 亚胺培南耐药、美罗培南敏感；R＋I. 亚胺培南耐药、美罗培南中介；R＋R. 亚胺培南、美罗培南双耐药。 
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表 2 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌对19种抗生素敏感性
Table 2 Sensitivity of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomnas aeruginosa to 19 kinds of antibiotics in Jiangsu province, 2016−2023
抗生素种类 抗生素名称 耐药 中介 敏感 菌株数 构成比（%） 菌株数 构成比（%） 菌株数 构成比（%） 酰胺醇类 氯霉素 68 100.00 0 0.00 0 0.00 磺胺类 复方新诺明 68 100.00 0 0.00 0 0.00 碳青霉烯类 亚胺培南 68 100.00 0 0.00 0 0.00 美罗培南 57 83.82 8 11.76 3 4.42 头孢菌素类 头孢噻肟 68 100.00 0 0.00 0 0.00 头孢他啶 33 48.53 8 11.76 27 39.71 头孢唑啉 68 100.00 0 0.00 0 0.00 头孢吡肟 35 51.47 13 19.12 20 29.41 四环素类 四环素 68 100.00 0 0.00 0 0.00 喹诺酮类 环丙沙星 34 50.00 8 11.76 26 38.24 左氧氟沙星 43 68.24 4 5.88 21 30.88 氨基糖苷类 阿米卡星 4 5.88 0 0.00 64 94.12 庆大霉素 11 16.18 4 5.88 53 77.94 青霉素类 氨苄西林 68 100.00 0 0.00 0 0.00 氨苄西林–舒巴坦 68 100.00 0 0.00 0 0.00 哌拉西林 25 36.76 7 10.29 36 52.95 单环内酰胺类 氨曲南 35 51.47 11 16.18 22 32.35 β-内酰胺类 哌拉西林–他唑巴坦 23 33.82 12 17.65 33 48.53 阿莫西林–克拉维酸 68 100.00 0 0.00 0 0.00
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表 3 2016－2023年江苏省68株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药谱
Table 3 Drug resistance pattern of 68 strains of carbapenem-resistant Pseudomnas aeruginosa in Jiangsu province, 2016−2023
非敏感药物数（种） 非敏感药物谱 菌株数(株) 构成比(%) 19 AN-AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 2 2.94 18 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 2 2.94 AN-AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 17 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 6 8.82 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TE-SXT 1 1.47 16 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 3 4.41 AN-AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 15 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-IPM-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 4 5.88 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-IPM-LVX-MEM-PIP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT 1 1.47 14 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-GM-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 13 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-CAZ-C-IPM-MEM-TZP-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-C-CPI-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 12 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 4 5.88 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-CIP-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 4 5.88 AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-C-CIP-IPM-LVX-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-PIP-TE-SXT 1 1.47 11 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-ATM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-CIP-IPM-LVX-TE-SXT 2 2.94 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-IPM-LVX-MEM-TE-SXT 1 1.47 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-GM-IPM-MEM-TE-SXT 1 1.47 10 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-IPM-MEM-TE-SXT 6 8.82 9 AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-IPM-TE-SXT 8 11.76 注：C. 氯霉素；SXT. 复方新诺明；IPM. 亚胺培南；MEM. 美罗培南；CTX. 头孢噻肟；CAZ. 头孢他啶；CZ. 头孢唑啉；FEP. 头孢吡肟；TE. 四环素；CIP. 环丙沙星；LVX. 左氧氟沙星；AN. 阿米卡星；GM. 庆大霉素；AM. 氨苄西林；SAM. 氨苄西林–舒巴坦；PIP. 哌拉西林；ATM. 氨曲南；TZP. 哌拉西林–他唑巴坦；AMC. 阿莫西林–克拉维酸。
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[1] 王雪玉, 田芳英, 赵明. 全球铜绿假单胞菌医院感染暴发事件的流行特征与应对策略[J]. 中国感染控制杂志,2022,21(12):1171−1178. DOI:10.12138/j.issn.1671−9638.20223388. Wang XY, Tian FY, Zhao M. Epidemic characteristics and preventive strategies of worldwide outbreak of healthcare-associated infection caused by Pseudomonas aeruginosa[J]. Chin J Infect Control, 2022, 21(12): 1171−1178. DOI: 10.12138/j.issn.1671−9638.20223388.
[2] Verdial C, Serrano I, Tavares L, et al. Mechanisms of antibiotic and biocide resistance that contribute to Pseudomonas aeruginosa persistence in the hospital environment[J]. Biomedicines, 2023, 11(4): 1221. DOI: 10.3390/biomedicines11041221.
[3] Fu Y, Zhao F, Lin J, et al. Antibiotic susceptibility patterns and trends of the gram-negative bacteria isolated from the patients in the emergency departments in China: results of SMART 2016-2019[J]. BMC Infect Dis, 2024, 24(1): 501. DOI: 10.1186/s12879−024−09294−0.
[4] World Health Organization. WHO publishes list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed[EB/OL]. (2017−02−27)[2020−10−20]. https://www.who.int/news/item/27−02−2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgently-needed
[5] Vasquez-Rifo A, Veksler-Lublinsky I, Cheng ZY, et al. The Pseudomonas aeruginosa accessory genome elements influence virulence towards Caenorhabditis elegans[J]. Genome Biol, 2019, 20(1): 270. DOI: 10.1186/s13059−019−1890−1.
[6] Curran B, Jonas D, Grundmann H, et al. Development of a multilocus sequence typing scheme for the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(12): 5644−5649. DOI: 10.1128/JCM.42.12.5644−5649.2004.
[7] Del Barrio-Tofiño E, López-Causapé C, Oliver A. Pseudomonas aeruginosa epidemic high-risk clones and their association with horizontally-acquired β-lactamases: 2020 update[J]. Int J Antimicrob Agents, 2020, 56(6): 106196. DOI: 10.1016/j.ijanti micag.2020.106196.
[8] Malhotra S, Hayes Jr D, Wozniak DJ. Cystic fibrosis and Pseudomonas aeruginosa: the host-microbe interface[J]. Clin Microbiol Rev, 2019, 32(3): e00138−18. DOI: 10.1128/CMR.00138−18.
[9] Cabrera R, Fernández-Barat L, Vázquez N, et al. Resistance mechanisms and molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa strains from patients with bronchiectasis[J]. J Antimicrob Chemother, 2022, 77(6): 1600−1610. DOI: 10.1093/jac/dkac084.
[10] 梁美春, 王瑶琴, 张小姣. 同一医院不同ICU病区患者痰中细菌学的分布与耐药性比较[J]. 疾病监测,2018,33(4):333−338. DOI:10.3784/j.issn.1003−9961.2018.04.017. Liang MC, Wang YQ, Zhang XJ. Comparison of distribution and drug resistance of bacteria in sputum culture in different ICU wards of same hospital[J]. Dis Surveill, 2018, 33(4): 333−338. DOI: 10.3784/j.issn.1003−9961.2018.04.017.
[11] Horcajada JP, Montero M, Oliver A, et al. Epidemiology and treatment of multidrug-resistant and extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections[J]. Clin Microbiol Rev, 2019, 32(4): e00031−19. DOI: 10.1128/CMR.00031−19.
[12] Ozer EA, Nnah E, Didelot X, et al. The population structure of Pseudomonas aeruginosa is characterized by genetic isolation of exoU+ and exoS+ Lineages[J]. Genome Biol Evol, 2019, 11(7): 1780−1796. DOI: 10.1093/gbe/evz119.
[13] Lacasa MA, Portillo ME, Palanco JL, et al. Molecular epidemiology of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa acquired in a Spanish intensive care unit: using diverse typing methods to identify clonal types[J]. Microorganisms, 2022, 10(9): 1791. DOI: 10.3390/microorganisms10091791.
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