2017-2022年浙江省湖州市食源性腹泻病例中副溶血弧菌血清型分析

陈莉萍, 张鹏, 董芬芬, 纪蕾

陈莉萍, 张鹏, 董芬芬, 纪蕾. 2017-2022年浙江省湖州市食源性腹泻病例中副溶血弧菌血清型分析[J]. 疾病监测, 2024, 39(11): 1455-1459. DOI: 10.3784/jbjc.202402180092
引用本文: 陈莉萍, 张鹏, 董芬芬, 纪蕾. 2017-2022年浙江省湖州市食源性腹泻病例中副溶血弧菌血清型分析[J]. 疾病监测, 2024, 39(11): 1455-1459. DOI: 10.3784/jbjc.202402180092
Chen Liping, Zhang Peng, Dong Fenfen, Ji Lei. Analysis on serotypes of Vibrio parahaemolyticus isolated from foodborne diarrhea cases in Huzhou, Zhejiang, 2017−2022[J]. Disease Surveillance, 2024, 39(11): 1455-1459. DOI: 10.3784/jbjc.202402180092
Citation: Chen Liping, Zhang Peng, Dong Fenfen, Ji Lei. Analysis on serotypes of Vibrio parahaemolyticus isolated from foodborne diarrhea cases in Huzhou, Zhejiang, 2017−2022[J]. Disease Surveillance, 2024, 39(11): 1455-1459. DOI: 10.3784/jbjc.202402180092

2017-2022年浙江省湖州市食源性腹泻病例中副溶血弧菌血清型分析

基金项目: 浙江省医药卫生科技计划项目(No. 2023KY1184)
详细信息
    作者简介:

    陈莉萍,女,浙江省富阳市人,副主任技师,硕士,主要从事微生物检验工作

    通讯作者:

    陈莉萍,Tel:0572−2760126,Email:lipingchen1106@hotmail.com

  • 中图分类号: R211;R378.3

Analysis on serotypes of Vibrio parahaemolyticus isolated from foodborne diarrhea cases in Huzhou, Zhejiang, 2017−2022

Funds: This study was supported by the fund for Zhejiang Provincial Medical and Health Technology Plan Project (No. 2023KY1184)
  • 摘要:
    目的 

    了解浙江省湖州市食源性腹泻病例中副溶血弧菌菌株的血清型别及分子分型特征,为预防食源性疾病提供科学依据。

    方法 

    对分离自腹泻患者的副溶血弧菌菌株开展血清学分型、毒力基因检测,采用多位点序列分型(MLST)分析菌株之间的遗传关系。

    结果 

    2017—2022年湖州市食源性疾病腹泻病例分离688株副溶血弧菌,共鉴定出33个血清型,其中以O3:K6(48.84%)、O10:K4(16.72%)和O4:KUT(12.79%)为优势型别。 毒力基因型别以tlh+ tdh+ trh-为主(96.51%);核心基因MLST分析显示O3:K6和O10:K4各自聚成一支,O4:KUT分成3部分,明显分成2支的分别是2020年和2022年分离的菌株,另外还有2株2020年的O4:KUT和O3:K6菌株聚在一起。 序列分析表明,69株副溶血弧菌有8种耐药相关基因,涉及4种抗生素类别。

    结论 

    湖州市副溶血弧菌优势血清型别已经发生明显变化。 应持续进行副溶血弧菌血清型及分子特征监测,关注近几年检出率上升的血清型O10∶K4和O4:KUT引起大流行的可能性。

    Abstract:
    Objective 

    To understand the serotype and molecular characteristics of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from foodborne diarrhea cases in Huzhou, Zhejiang province, and provide evidence for the prevention and control of foodborne diseases.

    Methods 

    Serological typing, virulence gene testing, and multilocus sequence typing (MLST) were performed for the V. parahaemolyticus strains isolated from diarrhea cases.

    Results 

    From 2017 to 2022, a total of 688 strains of V. parahaemolyticus were isolated from foodborne diarrhea cases in Huzhou, and 33 serotypes were identified, in which O3: K6 (48.84%), O10: K4 (16.72%), and O4: KUT (12.79%) were predominant. The main virulence genotype was tlh+tdh+trh- (96.51%). Serotypes O3: K6 and O10: K4 all belonged to ST3, while serotype O4: KUT was divided into 3 STs, ST3, ST332 and ST2516/265. Core-genome MLST clustering analysis showed that O3:K6 and O10:K4 were basically clustered together. O4: KUT was clearly divided into three parts, and only the strains isolated in 2020 and 2022 could be divided into 2 clades. Sequence analysis revealed that 69 strains of V. parahaemolyticus carried 8 resistance related genes, involving 4 antibiotic categories.

    Conclusion 

    The predominant serotypes of V. parahaemolyticus in Huzhou had shifted obviously. It is necessary to carry out consecutive surveillance for serotypes and molecular characteristics of V. parahaemolyticus and pay attention to the possibility of a pandemic caused by serotypes O10: K4 and O4: KUT with increased detection in recent years.

  • 副溶血弧菌是一类革兰阴性嗜盐和嗜碱性菌,属于弧菌属,主要存在于海产品中,可引起人类急性肠胃炎和败血症1。我国食源性疾病暴发事件中,由微生物引起的发病数最多,其中副溶血弧菌作为重要的食源性致病菌,其所引起的食源性疾病事件在生物原因事件中占首位23。通过连续监测食源性疾病腹泻病例中致病菌分布情况发现,浙江省湖州市副溶血弧菌的检出率仅次于致泻性大肠埃希菌4,是近年来本地重要的食源性致病菌。

    副溶血弧菌相关感染由多种血清型引起,血清分型基于菌体O抗原和荚膜多糖K抗原5。目前已经鉴定出13种O抗原和71种K抗原6。自1996年以来,副溶血弧菌的O3:K6血清型在中国7和其他国家8广泛流行。2013年出现新血清型O4:KUT,并且短时间内在中国占主导地位9。本研究对2017-2022年湖州市食源性腹泻病例中分离的副溶血弧菌的血清分型、毒力基因携带情况及分子分型特征进行研究,掌握本地区副溶血弧菌的优势血清轮换情况,为该菌引起的食源性疾病防控提供数据支撑。

    2017-2022年湖州市3家食源性疾病监测哨点医院从腹泻病例标本中分离到的副溶血弧菌菌株,共688株。

    VITEK 2 Compact细菌及药敏鉴定仪(法国生物梅里埃),ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。弧菌显色培养基、副溶血弧菌O及K诊断血清(日本生研株式会社);副溶血弧菌(tlhtdhtrh)三重核酸检测预分装试剂盒(北京卓诚惠生生物科技股份有限公司)。

    按照 GB 4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》10进行O抗原和K抗原的制备和鉴定。血清型以O抗原型与K抗原型(O:K)组合表示,O抗原不可分群和K抗原不可分型分别以OUT和KUT(untypeable,UT)表示。

    按照试剂盒配套的细菌DNA提取试剂进行核酸提取。按照试剂盒说明书配制反应体系,设置反应条件,采用多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进行tlhtdhtrh毒力基因检测。

    对69株优势血清型(12株O3:K6,39株O10:K4,18株O4:KUT)的菌株进行WGS。测序采用illumina NovaSeq测序平台,由上海伯杰医疗科技股份有限公司完成。采用FastQC(v0.11.9)软件进行质控分析,fastp(v0.23.2)软件进行低质量数据的去除,通过SPAdes_3.13.2(https://github.com/ablab/spades)进行拼接组装。副溶血弧菌的序列类型(sequence type,ST)和核心基因数据在PubMLST网站获取(https://pubmlst.org/organisms/vibrio-parahaemolyticus)。根据7个管家基因(dnaEgyrBrecAdtdSpntApyrCtnaA)的编号获得菌株ST型。每株菌所有核心等位基因的组合形成了一个等位基因图谱,用于生成最小生成树。最小生成树是在BioNumerics软件中使用核心基因MLST等位基因图谱作为输入数据构建的。聚类算法采用算术平均的非加权组平均法。通过计算成对等位基因差异的数量来计算成对距离。菌株耐药基因采用抗性基因数据库(comprehensive antibiotic resistance database,CARD)(https://card.mcmaster.ca/)来进行预测。

    2017-2022年共收集食源性腹泻病例中副溶血弧菌688株。血清型别众多,其中以O3:K6为主,占48.84%,O10:K4占16.72%,O4:KUT占12.79%(图1)。2017-2019年每年收集140~150株,2020-2022年每年收集80株左右。O3:K6在2017-2020年占绝对优势(45.68%~81.51%);2021年构成比下降至5.68%;2022年有所回升(13.41%),但没有明显优势。O10:K4血清型在2020年第一次被检测到,且在菌株中构成比较高(13.58%);2021年构成比为81.82%,成为2021年唯一的优势血清型;2022年构成比为39.02%,还是最主要的血清型。O4:KUT血清型在2017-2021年一直存在,构成比为3.41%~17.28%,2022年构成比为29.27%(图1)。

    图  1  2017-2022年湖州市腹泻病例分离的副溶血弧菌3种主要血清型检出情况
    Figure  1.  Detections of three main serotypes of Vibrio parahaemolyticus from diarrhea cases in Huzhou, 2017−2022

    688 株副溶血弧菌以tlh+tdh+trh-为主(664株),tlh+tdh-trh+占0.87%(6株),tlh+tdh+trh+占0.44%(3株),tlh+tdh-trh-占2.18%(15株)。

    由于2019年以前没有监测到O10:K4血清型,所以本研究从2020-2022年的3种优势血清型(O3:K6,O10:K4,O4:KUT)菌株中随机挑取部分进行WGS。获得了12株O3:K6、39株O10:K4、18株O4:KUT菌株的WGS数据。MLST分型显示,O3:K6和O10:K4菌株全部是ST3,O4:KUT菌株包含ST3、ST332和ST2516/265。ST2516/265在PubMLST上分型为ST2516,具有recA岛,在以前的报告中也被命名为ST265 11。从NCBI下载了相同ST的副溶血弧菌序列和本研究中的序列一起构建了基于核心基因MLST的最小生成树。相同ST的菌株基本聚成一支,除了1株ST3菌株和10株ST332菌株聚成一支,2株ST332菌株和全部的ST3菌株聚到一起。血清型O3:K6和O10:K4菌株基本聚成一支,血清型O4:KUT分成3部分,明显分成两支的分别是2020年分离到的ST332菌株和2022年分离到的ST2516/265菌株,另外还有2株2020年分离到的O4:KUT(ST3)和O3:K6菌株聚在一起(图2)。

    图  2  2017-2022年湖州市腹泻病例分离的69株副溶血弧菌基于核心基因多位点序列分型的最小生成树图
    注:圆圈大小代表菌株数量;ST.序列型。
    Figure  2.  Minimum spanning tree of 69 Vibrio parahaemolyticus strains based on core gene multilocus sequence typing

    将69株副溶血弧菌的全基因组序列与CARD数据库比对和分析后,发现涉及4种抗生素类别(β-内酰胺类、四环素类、糖肽类抗生素、大环内酯类抗生素)和8个耐药相关基因。其中TxRadeFvanT gene in vanG cluster、CRP、parE 5个耐药基因为3种血清型共有;CARB-22是血清型O3:K6和O10:K4共有的耐药基因;PBP3 和CARB-18 是血清型O4:KUT特有的耐药基因。

    副溶血弧菌一般分布在河口和沿海环境中,食用被该菌污染的生的或未煮熟海鲜会导致腹泻12。该菌是湖州市食源性致病菌中的主要致病菌,并且导致本地多起暴发事件1314。根据Yang等15研究,湖州市由副溶血弧菌引起的暴发疫情可能被低估,并且作为沿海地区,是副溶血弧菌引起疫情的潜在热点。需持续进行血清型及分子特征监测,及时发现可能引起大流行的变异株。

    本研究中湖州市副溶血弧菌临床分离株血清型呈现明显多样性,其中2017-2020年以O3:K6为主,与国内其他地区的监测结果一致1621。2021-2022年优势血清型变为O10:K4,与2021年浙江省温州市副溶血弧菌临床分离株监测结果基本一致22

    副溶血弧菌是一种极易发生重组的细菌2325,围绕O和K抗原编码基因簇的基因重组将导致该细菌的血清型转化。除了已知的抗原外,最近还分离出了具有不可分型或新O或K抗原的副溶血弧菌826。非O3:K6血清型被越来越多地分离出来,其中大多数菌株具有大流行的潜力927。O10:K4血清型出现后在本地也引发了几次局部疫情14。近几年O10:K4血清型在国内外也有报道,甚至引起了多起暴发疫情2830。本研究2020年分离的O4:KUT菌株(除2株ST3外)和O4:KUT2均属于ST332。2020年在湖州市分离的O4:KUT菌株可能是以前流行的O4:KUT2菌株。2022年分离的O4:KUT菌株与O4:KUT2菌株不同。近几年O4:KUT血清型在本地一直存在,且2022年构成比突然增加到30%左右,已经成为食源性腹泻病例中的优势血清型之一,与黄瑛等31研究结果一致。有研究报道O3:K6血清型有很多血清变种8。本研究检测到的优势血清型O10:K4和O4:KUT均为O3:K6大流行株血清变种的一种。O10:K4和O4:KUT有引起大流行的潜力,未来副溶血弧菌可能会出现更多具有流行潜力的新抗原。

    副溶血弧菌菌株中tdh和/或trh基因的存在已被证明可快速诱导炎症性肠胃炎32,这一特性通常用于确定副溶血弧菌菌株的致病性。研究表明高达90%的临床分离株具有tdh和/或trh基因3336。本研究表明,90%以上的菌株携带tdh和/或trh基因,与之前研究结果一致。有2.18%菌株未携带tdhtrh基因,远低于江苏省报道结果(约12%)37。有报道称tdhtrh均阴性的临床分离株占比低于10%3638,可能因不同地区不同年份检出菌株毒力基因携带情况不一致。

    随着抗生素的广泛使用,细菌的耐药性问题变得越来越严重。之前的研究表明,湖州市有超过86%的副溶血弧菌临床分离株对氨苄西林耐药,约2%~4%的菌株对庆大霉素和四环素耐药39。耐药基因检测显示,与β-内酰胺类抗生素相关的基因最多,与四环素类相关的耐药基因也存在,与耐药表型结果基本相符。

    核心基因组MLST分析显示,菌株聚类基本上按照不同的血清型来聚类,但也有不同血清型的菌株聚类在一起,有相同血清型的菌株分成明显的两支。2020-2022年O3:K6和O10:K4血清型基本未发生大的变化,都各自聚在一起。但O4:KUT菌株发生了较大变化。2020年和2022年菌株完全分在不同的支上。2022年O4:KUT成为优势血清型可能就是在基因水平发生了变化,在人群中传播能力增强。但O和K抗原编码基因簇的基因没有变化,所以血清型没有变化。本研究存在不足,2021年O4:KUT菌株未进行测序,因为这一年只检测到3株O4:KUT菌株。WGS技术相比于脉冲场凝胶电泳分型技术,能更加快速准确地完成菌株之间的溯源分析,可以从基因层面分析毒力基因和耐药基因,有助于研究预防食源性疾病暴发的策略,开发用于临床治疗的新药物。

    利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

  • 图  1   2017-2022年湖州市腹泻病例分离的副溶血弧菌3种主要血清型检出情况

    Figure  1.   Detections of three main serotypes of Vibrio parahaemolyticus from diarrhea cases in Huzhou, 2017−2022

    图  2   2017-2022年湖州市腹泻病例分离的69株副溶血弧菌基于核心基因多位点序列分型的最小生成树图

    注:圆圈大小代表菌株数量;ST.序列型。

    Figure  2.   Minimum spanning tree of 69 Vibrio parahaemolyticus strains based on core gene multilocus sequence typing

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出版历程
  • 收稿日期:  2024-02-17
  • 网络出版日期:  2024-10-18
  • 发布日期:  2024-08-22
  • 刊出日期:  2024-11-29

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