利用脉冲场凝胶电泳筛选质粒方法的建立和应用
关红, 秦天, 周海建, 任红宇, 段永翔, 许欣, 邵祝军
2013,28(1) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.1.018
目的 改良及优化常规脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)方法,建立基于PFGE技术筛选细菌质粒方法,并用于军团菌质粒的筛选。 方法 使用含有质粒的杜莫氏军团菌及其质粒消除株对常规PFGE方法进行条件优化,调整细菌菌悬液浓度,蛋白酶K用量及作用时间,胶块清洗时间和次数,胶块不经过酶切直接进行PFGE,染色成像后选择能形成条带清晰脱尾较少的最优条件。 结果 去除常规PFGE方法中酶切步骤并优化裂解和清洗条件能使细菌DNA完整保留在胶块中,经过PFGE后,质粒DNA和染色体DNA在琼脂糖凝胶上能被很好的区分。 结论 该方法较常规方法更为快速可靠,可用于细菌质粒图谱的快速筛选。
关键词: 质粒, 脉冲场凝胶电泳, 军团菌
脉冲场凝胶电泳用于军团菌分型能力的评价
秦天, 任红宇, 周海健, 邵祝军
2011,26(3) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2011.03.006
目的 评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术用于军团菌属不同种(Legionella species)以及不同血清型菌株的分型能力。 方法 选用117株10个嗜肺军团菌血清型,30种非嗜肺军团菌的参考菌株和我国环境分离菌株,采用AscⅠ内切酶酶切,进行PFGE。从电泳条带的数量和分布、PFGE的分型力、分辨率和与流行病学资料的相关性等4个方面评价PFGE用于军团菌属不同血清型的嗜肺军团菌以及30个非嗜肺军团菌种分型的能力。 结果 通过AscⅠ酶切、PFGE电泳后,所有血清型的嗜肺军团菌和17种非嗜肺军团菌能获得条带数量适合、且在电泳图谱上条带分布均匀,而另外13种非嗜肺军团菌株条带集中在小分量片段;PFGE能对所有117株选入实验的军团菌进行分析,分型力为100%;AscⅠ-PFGE将43株不同来源的各血清型嗜肺军团菌分成41个不同的型,分型D值为0.9978,将30株非嗜肺军团各自分为不同的型;AscⅠ-PFGE可以将相同来源的嗜肺军团菌和L. micdadei军团菌分为相同或者相似的型,成簇聚类。 结论 AscⅠ-PFGE对所有血清型的嗜肺军团菌和17种非嗜肺军团菌进行PFGE分型, 能够获得高质量的电泳图谱,可成功用于嗜肺军团菌的流行病学调查。
关键词: 军团菌, 脉冲场凝胶电泳, 分子分型
四种检测方法用于上海市口岸管道水军团菌存在状况调查的研究
任红宇, 田桢干, 周海健, 关红, 秦天, 邵祝军
2014,29(6) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.201.06.009
目的 比较传统的平板培养法、普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, real-time PCR)和荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)结合荧光定量PCR的方法(EMA-荧光定量PCR)对管道水中军团菌的检测效果。 方法 于2010年对上海市2个口岸管道水进行采样,共采集132份。分别采用传统的平板培养法、普通PCR、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR对水样中军团菌进行定性和/或定量分析。 结果 对132份管道水标本进行军团菌定性检测,平板培养法、普通PCR、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR检出军团菌污染率分别为18.9%、20.5%、24.2%和24.2%。3种定量方法(平板培养法、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR)对阳性标本中军团菌定量数值分别为50~1320菌落形成单位/升(cfu/L)、 20~13 085基因单位/升(GU/L)和10~4480 GU/L。对于132份水样,3种方法对军团菌含量分析的定量数值大小差异有统计学意义(2=193.6, P0.01),其中荧光定量PCR的定量数值最高,EMA-荧光定量PCR的数值次之,平板培养的数值最低。 结论 上海市口岸管道水中军团菌污染率和含菌量高。荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR方法检测管道水中军团菌的灵敏度优于传统的培养方法, EMA-荧光定量PCR方法适合用于环境水体中军团菌活菌监测。
关键词: 军团菌, 管道水, 实时荧光定量聚合酶链反应, EMA-荧光定量PCR

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