多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌
吴晓芳, 韩建康, 纪蕾, 徐德顺, 陈莉萍, 沈月华, 查赟峰
2011,26(3) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2011.03.022
目的 建立可同时检测沙门菌、单增李斯特菌的双重实时荧光PCR快速检测方法,并应用于食品样品的检测。 方法 根据GenBank上下载的沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因的保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重实时荧光PCR反应体系。对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行评估,并应用于食品标本的检测。 结果 实验结果表明,该检测方法特异性强,对大肠埃希菌、志贺菌、副溶血性弧菌等其他病原菌进行检测均未产生交叉反应。对沙门菌和单增李斯特菌纯培养物的最低检出限分别可达10 cfu/ml和100 cfu/ml;并且重复性好,变异系数均小于5%;对80份食品标本同时采用本文建立的双重荧光PCR方法和单重荧光PCR方法以及传统的分离培养方法进行检测,结果显示本文建立的双重荧光PCR方法对两种病原菌的检测效果明显优于单重荧光PCR方法以及传统的分离培养法,整个检测过程可在10 h内完成,包括前增菌所用的6 h。 结论 本研究建立的多重实时荧光PCR方法能同时对沙门菌和单增李斯特菌进行快速检测,并且灵敏度高、特异性好,可为食源性疾病的病原学快速检测提供新的手段。
关键词: 沙门菌, 单增李斯特菌, 双重荧光PCR, 检测
双重荧光定量RT-PCR快速检测甲型和甲型H1N1流感病毒
沈月华, 纪蕾, 徐德顺, 韩建康, 吴晓芳, 查赟峰, 陈莉萍
2010,25(11) .
目的 建立双重荧光RT-PCR快速检测方法,用于甲型和甲型H1N1流感病毒的同时检测和鉴别诊断。 方法 针对甲型流感病毒M基因和甲型H1N1流感病毒NA基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感或甲型H1N1流感含漱液标本检测。 结果 该方法对甲型、甲型H1N1流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.01 TCID50和0.1 TCID50,具有较好的稳定性。可从疑似流感或甲型H1N1流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。 结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确检测甲型和甲型H1N1流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法。
关键词: 甲型流感病毒, 甲型H1N1流感病毒, 双重荧光RT-PCR, 检测
浙江省湖州市柯萨奇病毒A组16型分离株VP1区序列测定及系统进化分析
纪蕾, 吴晓芳, 陈莉萍, 徐德顺, 沈月华, 查赟峰, 朱晓娟
2014,29(6) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.201.06.007
目的 了解浙江省湖州市引起手足口病(HFMD)的柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)分离株的VP1区基因特征。 方法 采用荧光定量反转录聚合酶链反应方法,对2011-2012年湖州市538份HFMD临床标本进行肠道病毒核酸检测;采用RD、Hep2细胞对Cox A16核酸阳性的标本进行病毒分离。选取17株具有代表性的Cox A16分离株进行VP1区的序列测定和分析。 结果 2011-2012年湖州市HFMD的主要病原为Cox A16和肠道病毒71型(EV71);湖州地区Cox A16分离株VP1区的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.5%~100%和99.3%~100%。与Cox A16的B1基因亚型代表株核苷酸同源性最高,在系统进化树上与B1亚型代表株相聚在一起,并且同时存在B1a 和B1b 两个进化分支。 结论 湖州市的Cox A16分离株与国内其他地区类似,同属于B1基因亚型,并且有B1a 和B1b 两个进化分支共同进化和循环。
关键词: 手足口病, 柯萨奇病毒A组16型, 基因型
2014年浙江省湖州市急性腹泻患者诺如病毒感染及基因特征研究
沈月华, 纪蕾, 陈莉萍, 朱晓娟, 查赟峰, 徐德顺, 吴晓芳
2016,31(11) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.11.012
目的 了解2014年浙江省湖州市急性腹泻患者诺如病毒感染状况及基因特征,为加强感染性腹泻监测与综合防控工作提供依据。方法 收集2014年湖州市综合性三级乙等和二级甲等各一家医院的粪便标本797份,采用实时荧光定量PCR方法进行诺如病毒核酸检测,并对诺如病毒核酸阳性标本进行衣壳蛋白区的序列测定和分析。结果 797份粪便标本中149份检出诺如病毒核酸阳性,阳性率18.70%(149/797),以GⅡ基因型为主,占89.26%(133/149)。衣壳蛋白区序列的系统进化分析显示检出的诺如病毒有5种GⅠ型别和7种GⅡ型别,包括GⅠ.1、GⅠ.2、GⅠ.5、GⅠ.6、GⅠ.7、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.8、GⅡ.17、GⅡ.21,以GⅡ.4 Sydney_2012(55.5%)、GⅡ.17(25.5%)型为主。结论 诺如病毒在湖州市急性腹泻患者中存在较高感染,并且基因型别复杂,除了流行优势型别GⅡ.4外,2014年底还出现GⅡ.17型诺如病毒的流行,因此应加强诺如病毒腹泻监测工作,为今后疫情防控提供科学依据。
关键词: 诺如病毒, 腹泻, 基因分型
肠道病毒71型湖州分离株的遗传进化和重组分析
吴晓芳, 纪蕾, 徐德顺, 陈莉萍, 沈月华, 朱晓娟, 查赟峰
2016,31(7) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.07.008
目的 对湖州市肠道病毒71型(EV71)进行基因特征及重组特点分析。方法 对2011-2012年湖州市EV71分离株进行全基因组测序,并与其基因型及A组肠道病毒其他血清型的原型株进行全序列比对,使用Mega 4.0软件绘制系统进化树。然后利用Simplot 3.5.1软件进行相似性分析,对基因重组加以验证。结果 P1区系统进化分析显示,2011-2012年湖州市EV71株属于C4基因型的C4a亚型。P1、P2、P3区的系统进化和相似性分析证实湖州市分离株在非结构蛋白2B编码区存在EV71 C基因型和Cox A16、14、4型间重组。结论 2011-2012年湖州市EV71分离株为C4a亚型,与2004年以来中国大陆优势株流行趋势一致。EV71 C4基因型湖州市株存在型间重组现象。
关键词: 肠道病毒71型, 系统进化分析, 重组
2009-2012年浙江省湖州市甲3亚型流行株基因特性分析
徐德顺, 纪蕾, 陈莉萍, 吴晓芳
2013,28(1) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.1.007
目的 分析2009-2012年湖州市甲3亚型流感病毒主要抗原基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子变异特征。 方法 选择浙江省湖州市2009-2012年流感流行期间分离的甲3亚型代表株11株,提取病毒RNA,扩增HA1和NA基因,进行序列测定,用MegAlign软件分析处理。 结果 湖州市近几年甲3亚型流感流行株在HA1区的核苷酸长度均为987 bp,编码329个氨基酸;在NA区的核苷酸长度为1362 bp,编码454个氨基酸。2009-2012年甲3亚型流感病毒分离株HA1区与NA区的氨基酸同源性分别在94.7%~99.9%与96.2%~100.0%之间,HA1区的变异较NA区更大。4个流感流行期分离的甲3亚型流感毒株相比HA和NA发生了多个氨基酸位点的替换。此外,近几年来世界卫生组织推荐的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间存在一定的差异。 结论 2009-2012年湖州市甲3亚型流感病毒流行株发生明显变异,基因重配和抗原漂移是病毒发生变异的主要机制。
关键词: 血凝素, 神经氨酸酶, 甲3亚型, 基因特性
GⅡ型诺如病毒衣壳蛋白抗原表位预测及单克隆抗体的制备
陈莉萍, 纪蕾, 吴晓芳, 徐德顺, 韩建康
2014,29(1) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2014.01.018
目的 原核表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,制备抗诺如病毒衣壳蛋白VP1的单克隆抗体,并研究其抗原表位特性。方法 PCR扩增GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白基因,将目的基因克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌原核表达。纯化表达产物免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。用Modeller9.9为诺如病毒GⅡ型湖州株VP1蛋白构建三维模型,构建好的三维模型提交到SEPPA在线B-cell 空间表位预测软件,对GⅡ型湖州株VP1蛋白进行空间表位预测。用预测的表位序列来筛选阳性克隆,得到对应这些表位的单克隆抗体。结果 成功构建重组表达载体pET28a(+)-Noro-VP1并在大肠埃希菌中获得表达,重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用预测的抗原表位多肽筛选,获得10株杂交瘤细胞株。与重组蛋白的ELISA结果显示1E8、1P10、2C15和2L16四株反应性最强,其他几株反应性较弱。Western blotting结果显示只有2K10、1K16、1E8三株能与重组蛋白很好的结合。结论 成功制备了抗GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白的单克隆抗体,抗原表位位于衣壳蛋白的P2区,为制备诺如病毒快速免疫诊断试剂盒及抗原表位的研究提供基础。
关键词: 诺如病毒, 衣壳蛋白, 单克隆抗体, 抗原表位
一起诺如病毒Ⅰ、Ⅱ型混合感染引起的感染性腹泻疫情调查
吴晓芳, 徐德顺, 纪蕾
2009,24(8) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961-2009.08.012
目的应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测技术,对疑似诺如病毒感染引起的腹泻疫情标本进行核酸检测,为疫情控制提供准确可靠的技术支持。方法从18例粪便标本中提取RNA,进行诺如病毒核酸荧光定量RT-PCR检测。结果18份标本中有13份诺如病毒核酸RT-PCR检测阳性,阳性率为72.2%。其中6份标本中检出诺如病毒Ⅰ型;6份标本中检出诺如病毒Ⅱ型;有1份标本同时检出诺如病毒Ⅰ型、Ⅱ型。结论应用荧光定量RT-PCR技术,对诺如病毒进行核酸检测结果准确可靠。
关键词: 诺如病毒, 感染性腹泻, 荧光定量逆转录-聚合酶链反应
 实时荧光定量-聚合酶链反应检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究
徐德顺, 韩健康, 吴晓芳
2009,24(7) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2009.07.023
目的利用实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)技术,建立食品中金黄色葡萄球菌(金葡萄)污染的快速敏感特异的检测方法。方法以金葡菌的IFemB/I基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以金葡菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mgsup2+/sup浓度,以金葡菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8 mol/L、0.6 mol/L,Mgsup2+/sup浓度为3.5 mmol/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除金葡菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,最低检测限为44 cfu/ml。稳定性分析表明:同一样品重复检测3次IC/It值的变异系数均5%。检测样品结果显示real-time PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。
关键词: 食品, 金黄色葡萄球菌, TaqMan探针, 荧光定量PCR
霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术 快速检测方法的建立
吴晓芳, 徐德顺, 钟芬芳
2010,25(7) . doi: 10.3784/j.issn.1003-9961.2010.07.023
目的 将一种新颖的核酸扩增技术环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。 方法 针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。 结果 最佳反应时间为60 min,反应温度为65 ℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。 结论 该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。
关键词: 霍乱弧菌, 环介导等温扩增技术, 毒素基因ctxA, 检测

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